?LyoPrime Luna™ 探針一步法 RT-qPCR 預混凍干粉(含 UDG)用于靈敏檢測靶標 RNA,可在室溫條件下穩定保存。該凍干劑型與其液體劑型 [ Luna? 探針一步法 RT-qPCR 4X 預混液(含 UDG)(NEB #M3019)] 具備同樣卓越的性能和功效。
· 加入無核酸酶水即可快速復溶
· 未經復溶的凍干試劑,可室溫儲存長達 2 年
· 無需冷鏈運輸
· 單次檢測通量多達 5 個靶標
· Luna 溫啟動反轉錄酶與 Taq 熱啟動 DNA 聚合酶聯合使用,提高反應特異性及功效
· 優化的預混試劑中包含熱敏 UDG 和 dUTP,防止模板殘留污染
· 預混試劑還含有小鼠 RNase 抑制劑,可保持 RNA 的完整性
· 非熒光藍色示蹤染料避免加樣錯誤
· 與多種 qPCR 儀器兼容,包括需要高 ROX 或低 ROX 參比信號的儀器
·?New England Biolabs(簡稱 NEB) 和 Fluorogenics™ Limited(現為 NEB 的子公司)聯合開發

?LyoPrime Luna™ 探針一步法 RT-qPCR 預混凍干粉(含 UDG)可在室溫條件下運輸和保存。僅需加入無核酶水即可快速復溶并使用。該產品適用于水解探針法實時檢測靶標 RNA。經優化可同時對高達 5 個靶標進行靈敏、線性的多重檢測。穩定的凍干劑型可復溶成 2X 或 4X 濃度的預混液,以滿足各種上樣需求。
圖 1:LyoPrime Luna 為凍干型通用 RT-qPCR 試劑,其性能卓越并可穩定保存

LyoPrime Luna™ RT-qPCR 預混凍干粉(NEB #L4001)與 Luna RT-qPCR 4X 預混液(NEB #M3019)具備相同的性能,該凍干劑型可在室溫條件下運輸和保存。
該預混凍干粉包含一步法 RT-qPCR 需要的所有組分,優化的緩沖液中含有 Luna 溫啟動反轉錄酶、Taq 熱啟動 DNA 聚合酶、dNTPs 和小鼠 RNase 抑制劑。Taq 熱啟動 DNA 聚合酶與新型溫啟動反轉錄酶聯合使用,可通過基于適配體的可逆抑制來雙重控制酶的活性。這種溫控活化機制可避免熱循環前的非特異擴增,可在復溶后室溫建立體系。經基因工程改造的 Luna 溫啟動反轉錄酶具有更高的熱穩定性,最佳反應溫度為 55°C。此外,預混試劑中還添加了獨特矯正染料,可與多種 qPCR 儀器兼容,包括需要高 ROX 或低 ROX 參比信號的儀器。
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由于 RT-qPCR 靈敏度極高,因此避免 DNA 污染至關重要。該試劑含有熱敏 UDG 和 dUTP,可防止模板殘留污染(以往的擴增產物可作為后續反應的底物)。與 E.coli UDG 不同的是,熱敏 UDG 在溫度>50℃時可完全失活,因此對反應沒有影響。
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試劑包含非熒光藍色示蹤染料,可避免加樣錯誤。該示蹤染料與 qPCR 常用熒光基團的光譜沒有重疊,也不會干擾實時檢測。
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了解凍干工藝,或咨詢定制服務以滿足實驗需求,請訪問 www.neb.com/lyoprime。
?圖 2:凍干型和液體型 Luna RT-qPCR 預混試劑具備同樣優異的性能

A. 使用 LyoPrime Luna™ 探針一步法 RT-qPCR 預混凍干粉(含 UDG)(NEB #L4001) 或 Luna? 探針一步法 RT-qPCR 4X 預混液(含 UDG)(NEB #M3019) 對人 β-actin 靶標進行 RT-qPCR 檢測,模板上樣量為 8-log 濃度梯度(1 μg–0.1 pg Jurkat 總 RNA),每個濃度重復 4 次,使用 ABI? QuantStudio™ 6 Flex 儀器運行試驗。反應體系(20 μl)中,引物濃度為 400 nM,探針濃度為 200 nM,反應設置為產品推薦的循環條件。B. 凍干試劑(金色)和液體試劑(藍色)的標準曲線基本相同,即使在最低測試濃度下也展現出良好的線性度和重復性。
圖 3:LyoPrime Luna 多重檢測性能卓越

?使用 LyoPrime Luna™ 探針一步法 RT-qPCR 預混凍干粉(含 UDG)對 6-log 濃度梯度的 Jurkat 總 RNA(1 μg-10 pg)進行多重 RT-qPCR,實驗儀器為 Bio-Rad CFX96 熒光定量儀。結果顯示了 5 個人源靶基因的擴增標準曲線和擴增效率。反應體系(20 μl)中,引物和探針濃度均為 200 nM,反應設置為產品推薦的循環條件。在該多重反應中,5 個靶標均檢測到良好的線性度、擴增效率和 R2 值。
圖 4:LyoPrime Luna 凍干劑型與其液體劑型性能一致,且優于其它品牌

兩位實驗人員按照操作說明書,使用市售凍干 RT-qPCR 試劑分別對 8 個不同豐度、長度和 GC 含量的靶標(通過不同顏色顯示)進行一步法 RT-qPCR 測試。反應結果就以下方面進行評估:擴增效率、低樣品量檢測能力及無模板擴增值(ΔCq=無模板對照的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq)。此外,還評估了擴增結果的一致性、可重復性和總體曲線質量。結果顯示:LyoPrime Luna™ 探針一步法 RT-qPCR 預混凍干粉(含 UDG)(NEB #L4001)與其液體劑型 Luna? 探針一步法 RT-qPCR 4X 預混液(含 UDG)(NEB #M3019)性能一致,且優于其它凍干產品,
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了解 qPCR/RT-qPCR 綜合測試和“dots in boxes”點陣圖分析方法,請點擊https://www.neb.com/tools-and-resources/video-library/dots-in-boxes-visualization-of-qpcr-data
圖 5:凍干型和液體型 Luna 試劑均可對 SARS-CoV-2 病毒 RNA 進行靈敏檢測
本實驗使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 檢測試劑盒(NEB #E3019)中的引物和探針對 2019-nCoV_N1(N1, HEX)、2019-nCoV_N2(N2, FAM)和人源 RNase P(RP, Cy5)進行多重 RT-qPCR 檢測,實驗儀器為 Bio-Rad? CFX384 熒光定量儀。反應體系(5 μl)中,引物濃度為 400 nM,探針濃度為 200 nM,反應設置為產品推薦的循環條件。實驗樣品:將 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 對照 2 摻入到 5 ng/μl Jurkat 總 RNA 中。LyoPrime Luna RT-qPCR 凍干劑型與其液體劑型均展示出良好的線性定量能力(對于 5 和 10 拷貝的 SARS-CoV-2 RNA,N1 和 N2 基因 40 個重復的檢出率為 100%,28 個陰性對照重復均無假陽性)。在 96 孔板中測試的 20 μl 體系結果相同。
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圖 6:LyoPrime Luna 試劑可對不同傳染病靶標進行檢測和定量
分別使用病毒 RNA 基因(FAM)和人源 RNase P(Cy5)靶標的引物和探針進行 RT-qPCR 實驗,實驗儀器為 Bio-Rad CFX96 熒光定量儀。試驗樣品:將 100,000-10 拷貝的 ATCC? 合成病毒 RNA(基孔肯雅病毒:VR-3246SD;2 型登革熱病毒:VR-3229SD;寨卡病毒:VR-3252SD)摻入到 5 ng/μl 人源(Jurkat)總 RNA 中。每個靶標使用其對應的 ATCC 參考引物和探針序列。反應體系(20 μl)中,引物濃度為 400 nM,探針濃度為 200 nM,反應設置為產品推薦的循環條件。結果顯示:LyoPrime Luna RT-qPCR 預混凍干粉對于所有靶標的線性定量和檢測結果均非常理想。